如何使用Primer Premier 5软件设计PCR引物

攻读生物相关专业硕士、博士研究生或从事生物相关行业的人员经常会做到PCR实验，而进行PCR的实验的首要前提则是需要设计一对好的引物，只有引物设计得恰当、合理，那么PCR实验才能进行得顺利，并得到自己想要的目的扩增产物。设计PCR引物的网站、软件有很多种，但最经典的应该算是Primer Premier 5软件，目前为止，还有不少人用该软件设计引物，所以这里就简要介绍下如何用该软件进行一般PCR引物的设计。

首先下载安装并激活Primer Premier 5 软件，打开软件，点击左上角，选择“File”→ “New” →“DNA Sequence”，然后复制参考模板DNA序列，在输入框内点击Ctrl+V键，将DNA序列粘贴进来:

接着点击左上角“Primer”按钮，再点击“Search” 按钮：

然后选择并输入一些参数，一般最上面点击“PCR Primer”，下面选择“Pairs”,然后输入上游（正义，Sense）链引物及下游（反义，Anti-sense）链引物的设计位置范围，这个需要你预先知道你要扩增的片段在哪里，大概估算一下，比如我想扩增参考模板序列的200-2100中间这1900bp长度的片段，我的上游引物就在1-200之间，下游引物就在1900-最尾部之间；接着再输入一下PCR产物大小范围，很简单，比如我想要200-2100中间的1900bp ,那么最小的PCR产物大小应该是1900bp,当然，一般软件设计都会大于这个长度的，所以最大的长度可以不受限，但越长往往越难扩，所以适度就好，这里我就输入参考模板的最大长度；然后再选择一下设计的引物长短区间，一般23±3bp或5bp，引物长度越长，一般退火温度也会越高，搜索模式的话一般是选择自动“Automatic”：

接着按左下角的“OK”按钮，再点一次弹出窗口的“OK”：

这时，软件自动将已经设计好的引物展示在右上角的窗口，默认按引物对的分数从高到低进行排列，选中某一对引物后，左下角会出现该引物对的一些参数，可以让我们评判好坏，比如发夹结构、二聚体、有没有错配及引物的长度、起始位置、GC含量等，你可以根据自己的要求选择适合自己的引物，如果是小白的话，建议从分数最高的引物对开始测试PCR扩增效果。

最后，导出我们想到的引物对信息，点击“File”→ “Print” →“Current Pair”，选择“Primer Pair”进行打印，一般用虚拟PDF打印机如Adobe、福昕、Doro之类的，确定后选择保存位置、名字就可以了，后面我们可以打开输出的PDF软件浏览引物对的信息，并复制这些信息将其送到相应的生物公司进行引物对的合成。