怎么利用primer3plus快速设计菌落PCR验证引物
分子克隆是分子生物学实验的经典必备技能，不论过表达、干扰/敲除都离不开它。“分、切、接、转、筛”五字心法很是深入人心，但是真正实操起来其中又有多少填不完的坑……想必亲身经历过的小伙伴，内心是深有体会的。今天和大家分享一下怎么快速设计用于菌落鉴定的PCR引物
操作之前首先讲一下大概原则：1、一侧引物（上/下游）尽量位于载体质粒骨架上，另一侧位于插入目的基因序列上。2、PCR产物大小不宜超过1000bp或小于200bp。3、特殊情况时，亦可选用仅扩增部分插入片段的引物对（一般不建议，须同时辅助其他验证手段）。
接下来，咱们开始演示如何使用primer 3 plus来设计筛选引物。 打开primer 3 plus 引物设计页面，http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi
输入序列ID至下图编号1处，或复制粘贴或导入引物设计所需的模板序列（建议：部分质粒骨架序列+目的基因序列）至“Main”页面下空白对话框（编号2）处。设置“Load server settings”为”Default”， 同时 “Task”右侧下拉对话框，选择“generic”
点击下方“General Settings”进入子页面，于“Product Size Ranges”右侧对话框中输入产物bp数值范围（建议：500左右最佳。过大（>1000bp）增加PCR反应时间，太小（<150bp）不易与引物二聚体区分），可默认此页面其他参数不变
点击“Advanced Sequence”进入子页面，于“Force Left/Right Primer Start”右侧对话框中输入上游（左）/下游（右）引物起始位置序号（此操作即可将上游/下游引物设置在质粒骨架上）。
然后点击右上方“Pick Primers”，即可跳转至结果页面
方法二：如果已知上游（左）/下游（右）引物，可直接在“Main”页面下“or use left primer below”或“or use right primer below”处输入引物序列。再如步骤4操作限定产物大小，“Pick Primers”即可获得结果
最后只需要导出引物序列送公司合成
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